[:it]La resistenza a peronospora e oidio nella vite[:en]Resistance to peronospora and oidium in grapevine[:es]Resistencia al mildiu velloso en y en la vid[:]

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La resistenza a peronospora e oidio in vite: selezione assistita da marcatori molecolari

Nel ciclo di produzione della vite (Vitis spp.), è fondamentale il controllo fitosanitario, per preservare sia la produzione sia la qualità delle uve. Il controllo delle patologie, oidio e peronospora in primis, viene attuato principalmente attraverso l’uso di prodotti chimici. Negli ultimi anni, però, si sta cercando di ridurre gli input chimici nella gestione del vigneto per diversi fattori, come i problemi di impatto ambientale, la salute umana e anche quello dei costi per gli agricoltori. Un metodo sicuro volto a garantire produzioni abbondanti, di qualità e con un minimo uso di agrofarmaci è l’uso di varietà geneticamente resistenti ottenute tramite incrocio.
Il breeding tradizionale è troppo lento per sopperire alla costante ricerca di nuove varietà con diversi caratteri mentre la selezione attuata con biotecnologie molecolari e genetiche può aiutare enormemente il breeder nell’ottica del miglioramento genetico. In questo aspetto, i marcatori molecolari sono un enorme potenziale per migliorare l’efficienza e la precisione del breeding convenzionale attraverso la così detta “selezione assistita da marcatori molecolari” (MAS: marker assisted selection) la quale permette di applicare una selezione già nelle prime fasi di crescita vedendo la presenza dei tratti d’interesse direttamente nel DNA.

Raccolta polline

Introdurre resistenze
Obiettivo di questo lavoro è di introgredire in varietà coltivate, agronomicamente valide, geni di resistenza attraverso l’incrocio tra varietà donatrici di geni R e varietà, appunto, già in coltivazione oppure incrociare diverse accessioni di specie resistenti. Ulteriormente, l’obiettivo è anche di riscontrare diverse resistenze negli individui in modo tale da ottenere la piramidazione dei geni R e quindi ottenere varietà con uno spettro di resistenza più largo e maggiormente difensive.

Emasculazione portaseme

Materiali e metodi
Lo studio è iniziato con gli incroci tra le varietà o accessioni portanti i geni d’interesse e la varietà da migliorare. Si è innanzitutto raccolto il polline dal parentale maschile e poi si è emasculato il parentale femminile, si è poi eseguita l’impollinazione artificiale e in fine gli incroci sono stati protetti da contaminazioni esterne. Eseguiti gli incroci, al termine della stagione, dai grappoli sono stati estratti i semi e da questi si sono ottenute le nuove piante. Dalle foglie di queste nuove piante, il DNA è stato estratto con il metodo di Doyle e Doyle (1990) e poi è stato quantificato. Successivamente, per verificare la presenza dei geni in oggetto nel DNA, in primo luogo si sono effettuate delle PCR con i marcatori molecolari per i geni in oggetto, al fine di amplificare i tratti d’interessi. Successivamente, dal prodotto della PCR si è passati al sequenziamento dei frammenti allelici tramite elettroforesi capillare.

Impollinazione

Risultati
Sono stati condotti in tutto 8 incroci, 5 per migliorare l’uva da tavola per ottenere nuove varietà che portassero i geni di resistenza alle patologie e il carattere dell’apirenia e 3 incroci per migliorare varietà da vino sempre con i geni di resistenza. In particolare, per quanto concerne l’uva da tavola si sono migliorate le varietà Sultanina e Moscato, per ottenere appunto varietà similari ma resistenti. Altri incroci hanno previsto l’ibridazione di diverse accessioni resistenti per creare nuove varietà che portassero le resistenze e il carattere apirenia. Per quanto concerne l’uva per la vinificazione si sono condotti incroci per migliorare le varietà Lambrusco e l’importante varietà Glera (il cui vino è il prosecco) con geni di resistenza donati da accessioni che portano nel proprio genoma questi geni. In ultimo si sono volute ottenere nuove varietà con tutti e 3 i geni di resistenza alla peronospora, incrociando la varietà già resistente Solaris, con un’altra accessione resistente.
Questo lavoro di miglioramento genetico è stato eseguito perché ad oggi, in viticoltura, vengono usati il 67% di tutti i fungicidi utilizzati in agricoltura, ricordando che la superficie occupata dalla vite è pari solo al 3,3% di tutta la superficie agricola mondiale. La coltivazione della vite quindi, specialmente per quanto concerne la protezione contro le malattie, risulta delicata. L’obiettivo di questo studio è stato quello di ottenere varietà resistenti e con caratteri importanti per il mercato che, quindi, necessitino di un uso minimo di fungicidi in modo da allinearsi in un ottica Green futura, seguendo quindi le direttive comunitarie.
Nel lavoro eseguito, per ogni famiglia analizzata, frutta dei singoli incroci, un grande numero di individui nella progenie ha ereditato i geni di resistenza.

Protezione degli incroci
Oltre al fatto dell’ottimo risultato nel aver ottenuto molti individui resistenti in tutti gli incroci effettuati, un aspetto molto importante è che, per ogni incrocio, si siano ottenuti un buon numero di individui portanti diverse combinazioni di geni di resistenza e altrettanti che hanno ereditato tutti i geni presenti nel singolo incrocio. In particolare questi sono i risultati che più vanno presi in considerazione. Ottenere varietà con piramidate più resistenze verso lo stesso patogeno e contemporaneamente più resistenze contro diversi patogeni è il risultato migliore che si possa avere. Questi individui infatti presenteranno un elevato grado di resistenza e sarà più difficile per il patogeno riuscire a superare queste barriere evolvendo tramite la selezione naturale. Questi individui con diverse resistenze piramidate sono la base di partenza per continuare con il miglioramento genetico anche per ulteriori caratteri. In questo lavoro, si sono ottenuti anche individui che portassero 3 geni di resistenza (fra peronospora e oidio, in diverse combinazioni) e il tratto dell’apirenia.
L’utilizzo delle conoscenze della genetica e le moderne tecniche molecolari per ottenere varietà migliorate, come per le resistenze alle malattie, sono, quindi, i mezzi più efficaci che abbiamo a disposizione per ottenere una riduzione drastica nell’uso dell’agro chimica. Inoltre, possiamo ipotizzare di associare ai caratteri di resistenza altri caratteri per molti tratti importanti. In questo modo, coltivatori, consumatori e ambiente potranno trarre indubbi vantaggi in termini di salute pubblica e conservazione dell’ecosistema in un’ottica di sviluppo sostenibile.

Giovanni Mian

Bibliografia
1. Caramelli David, Antropologia molecolare, Firenze University Press, 2009
2. EUROSTAT EC. The use of plant protection products in the European Union. Data 1992- 2003. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2007. ISBN 92-79-03890-7.
3. Bergamini et al, 2012. Validation assay of p3_VvAGL11 marker in a wide range of genetic background for early selection of stenospermocarpy in Vitis vinifera L
4. Jones JD, Dangl JL (2006) The plant immune system. Nature 444:323Kast WK, Stark-Urnau M, Seidel M, Gemmrich AR (2001) Interisolate variation of virulence of Plasmoparaviticola on resistant vine varieties. Bull OILB/SROP 24:45–49
5. Moroldo M, PaillardS,MarconiR,FabriceL,CanaguierA,Cruaud C etal. A physical map of the heterozygous grapevine ‘Cabernet Sauvignon’ allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC Plant Biol 2008; 8: 66. 31
6. Velasco R, Zharkikh A, Troggio M, Cartwright D, Cestaro A, Pruss D et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. PLoS ONE 2007; 2: e1326.
7. Wan Y, Schwaninger H, He P, Wang Y. Comparison of resistance to powdery mildew and downy mildew in Chinese wild grapes. Vitis. 2007;46:132. 16.

Sitografia
1) www.wikipedia.it
2) Rivistadiagraria.org
3) Agraria.org
4) Nature.com




[:en]

Resistance to peronospora and oidium in grapevine: selection assisted by molecular markers

In the vine production cycle (Vitis spp.), Phytosanitary control is fundamental, to preserve both the production and the quality of the grapes. Disease control, oidium and downy mildew in the first place, is mainly implemented through the use of chemical products. In recent years, however, efforts are being made to reduce chemical inputs in vineyard management for various factors, such as environmental impact issues, human health and even cost for farmers. A safe method to ensure abundant production, quality and with a minimum use of crop protection products is the use of genetically resistant varieties obtained by crossing.
The traditional breeding is too slow to make up for the constant search for new varieties with different characters while the selection carried out with molecular and genetic biotechnologies can greatly help the breeder in the perspective of genetic improvement. In this aspect, molecular markers are a huge potential to improve the efficiency and precision of conventional breeding through the so-called “molecular marker assisted selection” (MAS: marker assisted selection) which allows to apply a selection already in the first phases of growth by seeing the presence of the features of interest directly in the DNA.

Pollen collection

Introduce resistances
The aim of this work is to intrude in cultivated varieties, agronomically valid, resistance genes through the cross between varieties donating R genes and varieties, in fact, already in cultivation or cross different accessions of resistant species. Further, the objective is also to find different resistances in individuals so as to obtain the pyramidation of the R genes and then obtain varieties with a wider and more defensive resistance spectrum.

Portess emasculation

Materials and methods
The study began with the crossings between the varieties or accessions carrying the genes of interest and the variety to be improved. First the pollen was collected from the male parental and then the female parental was emasculated, then the artificial pollination was carried out and in the end the crossings were protected from external contamination. Once the crosses have been completed, at the end of the season the seeds have been extracted from the bunches and the new plants have been obtained from them. From the leaves of these new plants, DNA was extracted by Doyle and Doyle (1990) and then quantified. Subsequently, in order to verify the presence of the genes in question in the DNA, first of all the PCRs were made with the molecular markers for the genes in question, in order to amplify the traits of interest. Subsequently, from the PCR product, sequences of allelic fragments were sequenced by capillary electrophoresis.

Pollination

Results
A total of 8 crosses were carried out, 5 to improve the table grapes to obtain new varieties that would bring the resistance genes to pathologies and the character of apyrenia and 3 crossings to improve the variety of wine always with the resistance genes. In particular, as far as table grapes are concerned, the Sultanina and Moscato varieties have improved, in order to obtain similar but resistant varieties. Other intersections have foreseen the hybridization of different resistant accessions to create new varieties that bring resistance and apirenia character. As for the grapes for vinification, crossings were made to improve the Lambrusco varieties and the important Glera variety (whose wine is prosecco) with resistance genes donated by accessions that carry these genes into their genomes. Lastly, it was decided to obtain new varieties with all 3 downy mildew genes, crossing the already resistant Solaris variety, with another resistant accession.
This work of genetic improvement has been carried out because to date, in viticulture, 67% of all fungicides used in agriculture are used, bearing in mind that the area occupied by the vine is only 3.3% of the entire world agricultural area. Therefore the cultivation of the vine, especially as regards the protection against diseases, is delicate. The objective of this study was to obtain resistant varieties with important characteristics for the market, which therefore require a minimum use of fungicides in order to align themselves in a future Green perspective, thus following the Community directives.
In the work performed, for each family analyzed, fruit of the individual crosses, a large number of individuals in the progeny inherited the resistance genes.

Protection of crossings

Besides the excellent result of having obtained many resistant individuals in all the crossings carried out, a very important aspect is that, for each intersection, we have obtained a good number of individuals carrying different combinations of resistance genes and as many who have inherited all the genes present in the single intersection. In particular these are the results that must be taken into account. Obtaining varieties with pyramids more resistance to the same pathogen and at the same time more resistance against different pathogens is the best result one can have. These individuals will present a high degree of resistance and it will be more difficult for the pathogen to overcome these barriers by evolving through natural selection. These individuals with different pyramidal resistances are the starting point to continue with the genetic improvement also for further characters. In this work, we also obtained individuals who carried 3 resistance genes (between peronospora and oidium, in different combinations) and the tract of apyrenia.
The use of genetic knowledge and the modern molecular techniques to obtain improved varieties, as for the resistance to diseases, are, therefore, the most effective means we have available to obtain a drastic reduction in the use of chemical agro. Moreover, we can hypothesize to associate the characters of resistance with other characters for many important traits. In this way, growers, consumers and the environment will gain undoubted advantages in terms of public health and conservation of the ecosystem with a view to sustainable development.

Giovanni Mian

Bibliography
1. Caramelli David, Antropologia molecolare, Firenze University Press, 2009
2. EUROSTAT EC. The use of plant protection products in the European Union. Data 1992- 2003. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2007. ISBN 92-79-03890-7.
3. Bergamini et al, 2012. Validation assay of p3_VvAGL11 marker in a wide range of genetic background for early selection of stenospermocarpy in Vitis vinifera L
4. Jones JD, Dangl JL (2006) The plant immune system. Nature 444:323Kast WK, Stark-Urnau M, Seidel M, Gemmrich AR (2001) Interisolate variation of virulence of Plasmoparaviticola on resistant vine varieties. Bull OILB/SROP 24:45–49
5. Moroldo M, PaillardS,MarconiR,FabriceL,CanaguierA,Cruaud C etal. A physical map of the heterozygous grapevine ‘Cabernet Sauvignon’ allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC Plant Biol 2008; 8: 66. 31
6. Velasco R, Zharkikh A, Troggio M, Cartwright D, Cestaro A, Pruss D et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. PLoS ONE 2007; 2: e1326.
7. Wan Y, Schwaninger H, He P, Wang Y. Comparison of resistance to powdery mildew and downy mildew in Chinese wild grapes. Vitis. 2007;46:132. 16.

Sitography
1) www.wikipedia.it
2) Rivistadiagraria.org
3) Agraria.org
4) Nature.com




[:es]

Resistencia al mildiu velloso en y en la vid: Selección Asistida por Marcadores Moleculares

En el bucle de Producción de la vid (Vitis spp.), El control de plagas El es fundamental para Preservar tanto Como la Producción de la Calidad uvas. El control de de Enfermedades, y el oídio y el imprimación Lugar en mildiú velloso, aunque principalmente implementa un Través de Productos Químicos de uso. En los ultimos años, sin embargo, antes de darse cuenta si el costo: esfuerzos y párr ESTÁN Para Los Reducir INSUMOS Químicos En La Gestión del viñedo por DIVERSOS factors, Como los Problemas de impacto ambiental, la salud humana y se incluyen los Agricultores. Un Método seguro para Garantizar una abundante producción f, de Calidad y con un uso Mínimo de Productos fitosanitarios es el uso de Variedades Resistentes genéticamente obtenidas por cruzamiento.
La Reproducción tradicional es Demasiado lento para Compensar la constante búsqueda de Nuevas Variedades con Diferentes Caracteres MIENTRAS Que La Selección Implementado con BIOTECNOLOGÍA genética molecular y PUEDE Ayudar En El criador grandes Medida ES vista de la Mejora genética. En Este aspecto m, los Marcadores Moleculares soy un gran potencial para Mejorar la Eficiencia y la precisión Que de la Selección convencional un Través de la Llamada “Selección Asistida por Marcadores Moleculares” (MAS: Selección Asistida) marcador Que permite APLICAR una Selección ya en el imprimación fases de crecimiento al ver la presencia de las características de interés directamente en el ADN.

Colección de polen

Introducir resistencias
El objetivo de este trabajo es inmiscuir en variedades cultivadas, agronómicamente válidas, genes de resistencia a través del cruce entre variedades que donan genes R y variedades, de hecho, ya sea en cultivo o en diferentes accesiones de especies resistentes. Además, el objetivo también es encontrar diferentes resistencias en los individuos a fin de obtener la piramidación de los genes R y luego obtener variedades con un espectro de resistencia más amplio y más defensivo.

Emasculación de Portess

Materiales y métodos
El estudio comenzó con los cruces entre las variedades o accesiones portadoras de los genes de interés y la variedad a mejorar. Primero, el polen se recolectó del padre masculino y luego el progenitor femenino se emasculó, luego se llevó a cabo la polinización artificial y, al final, los cruces se protegieron de la contaminación externa. Una vez que se han completado los cruces, al final de la temporada las semillas se han extraído de los racimos y las nuevas plantas se han obtenido de ellos. De las hojas de estas nuevas plantas, el ADN fue extraído por Doyle y Doyle (1990) y luego cuantificado. Posteriormente, con el fin de verificar la presencia de los genes en cuestión en el ADN, en el primer lugar de PCR se llevaron a cabo con los marcadores moleculares para los genes en cuestión, con el fin de amplificar los rasgos de interés. Posteriormente, a partir del producto de PCR, las secuencias de fragmentos alélicos se secuenciaron mediante electroforesis capilar.

Polinización

Resultados
Se llevaron a cabo un total de 8 cruces, 5 para mejorar la uva de mesa para obtener nuevas variedades que aportarían genes de resistencia a patologías y el carácter de apyrenia y 3 cruces para mejorar la variedad de vino siempre con los genes de resistencia. En particular, en lo que respecta a las uvas de mesa, las variedades Sultanina y Moscato han mejorado, para obtener variedades similares pero resistentes. Otras intersecciones han previsto la hibridación de diferentes accesiones resistentes para crear nuevas variedades que traen carácter de resistencia y apirenia. En cuanto a las uvas para vinificación, se realizaron cruces para mejorar las variedades Lambrusco y la importante variedad Glera (cuyo vino es prosecco) con genes de resistencia donados por accesiones que llevan estos genes a sus genomas. Por último, se decidió obtener nuevas variedades con los 3 genes de mildiu velloso, cruzando la ya resistente variedad Solaris, con otra accesión resistente.
Este trabajo de mejora genética se ha llevado a cabo porque hasta la fecha, en la viticultura, se utiliza el 67% de todos los fungicidas utilizados en agricultura, teniendo en cuenta que el área ocupada por las vides es solo el 3,3% del área agrícola mundial. Por lo tanto, el cultivo de la vid, especialmente en lo que se refiere a la protección contra enfermedades, es delicado. El objetivo de este estudio fue obtener variedades resistentes con características importantes para el mercado, que por lo tanto requieren un uso mínimo de fungicidas para alinearse en una futura perspectiva Verde, siguiendo así las directivas comunitarias.
En el trabajo realizado, para cada familia analizada, fruto de cruces individuales, un gran número de individuos en la progenie heredaron los genes de resistencia.

Protección de cruces

Además del hecho de obtener los excelentes resultados en muchos individuos resistentes a todos los cruces realizados, un aspecto muy importante es que, para cada intersección, se han obtenido un buen número de individuos que llevan diferentes combinaciones de genes de resistencia y como muchos de los que han heredado todos los genes presentes en la intersección única. En particular, estos son los resultados que deben tenerse en cuenta. La obtención de variedades con pirámides más resistencia al mismo patógeno y al mismo tiempo más resistencia contra diferentes patógenos es el mejor resultado que uno puede tener. Estos individuos presentarán un alto grado de resistencia y será más difícil para el patógeno superar estas barreras evolucionando a través de la selección natural. Estos individuos con diferentes resistencias piramidales son el punto de partida para continuar con la mejora genética también para otros personajes. En este trabajo, también obtuvimos individuos que portaban 3 genes de resistencia (entre peronospora y oidio, en diferentes combinaciones) y el tracto de apyrenia.
El uso de la genética molecular y técnicas modernos de conocimiento para obtener variedades, como la resistencia a enfermedades mejorada, por lo tanto, son los medios más eficaces de que disponemos para lograr una reducción drástica en el uso de agroquímicos. Además, podemos hipotetizar asociar los caracteres de resistencia con otros caracteres para muchos rasgos importantes. De esta forma, los productores, los consumidores y el medioambiente obtendrán ventajas indudables en términos de salud pública y conservación del ecosistema con vistas al desarrollo sostenible.

Giovanni Mian

Bibliografía
1. Caramelli David, Antropologia molecolare, Firenze University Press, 2009
2. EUROSTAT EC. The use of plant protection products in the European Union. Data 1992- 2003. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2007. ISBN 92-79-03890-7.
3. Bergamini et al, 2012. Validation assay of p3_VvAGL11 marker in a wide range of genetic background for early selection of stenospermocarpy in Vitis vinifera L
4. Jones JD, Dangl JL (2006) The plant immune system. Nature 444:323Kast WK, Stark-Urnau M, Seidel M, Gemmrich AR (2001) Interisolate variation of virulence of Plasmoparaviticola on resistant vine varieties. Bull OILB/SROP 24:45–49
5. Moroldo M, PaillardS,MarconiR,FabriceL,CanaguierA,Cruaud C etal. A physical map of the heterozygous grapevine ‘Cabernet Sauvignon’ allows mapping candidate genes for disease resistance. BMC Plant Biol 2008; 8: 66. 31
6. Velasco R, Zharkikh A, Troggio M, Cartwright D, Cestaro A, Pruss D et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. PLoS ONE 2007; 2: e1326.
7. Wan Y, Schwaninger H, He P, Wang Y. Comparison of resistance to powdery mildew and downy mildew in Chinese wild grapes. Vitis. 2007;46:132. 16.

Sitografia
1) www.wikipedia.it
2) Rivistadiagraria.org
3) Agraria.org
4) Nature.com




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